哈喽大家好，关于质粒提取的注意事项很多朋友都还不太明白，不过没关系，因为今天小编就来为大家分享关于试剂盒提取质粒原理的知识点，相信应该可以解决大家的一些困惑和问题，假如碰巧可以解决您的问题，还望关注下本站哦，希望对各位有所帮助！
本文目录
一、植物基因工程实验技术-提取质粒
EP管是一种小型的离心管,又称为EP(eppendorf)管。可以与微型离心机配套使用,用于微量试剂的分离微量离心管离心。
rpm（离心机的转速单位，转rpm，以下简写为r）
查看预约离心机，相应抗生素LB液体要有，管子要有灭好的
从过夜培养的菌液中纯化得到的低拷贝质粒的得率大约为 0.1-1μg/mL，若要提取中低拷贝数的质粒 DNA，请遵循以下准则：
培养体积：使用高拷贝质粒菌培养基的 2倍体积。
使用 2倍体积的 Buffer A1，B1，N1，这些缓冲液可单独向 Biomiga购买。
使用与高拷贝质粒菌相同体积的 DNA Wash Buffer、Buffer KB
预约离心机，打开金属浴设定60℃，将EB/ddH2O预热，
拿大盘子准备：枪（1000& 100）、枪头（大&中）、离心管（2ml&1.5ml提几个拿几个）、剪成条条的滤纸、配平用的水+管子、计时器、质粒提取试剂盒
12000r 1min，收菌。弃废液，滤纸吸除干净，
check始终一边放管子，使得菌物沉淀到一边，否则沉淀物若沉到另一边的话，已沉淀的那边容易被带跑。
冰箱拿+250ul A1枪吹打，拒绝涡旋、拒绝气泡，加完放冰箱
+350ul N1轻转10次，关键是混合均匀
枪移液至柱子 12000r 1min弃废液-挂质粒
+500ul KB 12000r 1min弃废液-洗蛋白
+500ul DNAbuffer 12000r 1min弃废液-洗杂
重复+500ul DNAbuffer 12000r 1min弃废液-洗杂
将柱子转移到干净1.5ml中，加30ul EB静置1min后12000r 1min
下面步骤来自实验室的试剂盒，不同试剂盒步骤不一样。质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法，该试剂盒使用的是碱裂解法（说明书 ）。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：
1.接种新鲜的单个菌落到 1-5 mL LB培养基（含适量抗生素）， 37℃震荡培养 14-16 h。注：不建议培养时间超过 16 h，可能会导致大肠杆菌裂解从而降低质粒产量。➡️大肠杆菌分大摇小摇，挑单的菌需先小摇后大摇
或接 1%-5%含质粒的大肠杆菌细胞液体于 LB培养基。
Q假设摇菌时间过长，会出现什么问题？细菌死亡还是？？？
A可能导致菌裂解，这样会降低产量，不能超16h。
注：请勿从冻存的甘油菌直接培养。
注：此步骤适用于 LB培养的大肠杆菌，当使用 TB或者 2xYT培养基时，需要特别注意 OD600不要超过 3.0。当使用了过量的培养基，对应的 Buffer的体积需要对应增加。
2. 12,000 rpm离心 1 min，弃上清，将管子倒置于纸巾上，去除残留培养基。注：残留的液体培养基容易导致菌体裂解不完全，从而降低产量。
3.加入 250μL Buffer A1(使用前加入 RNase A)，用移液器或涡旋震荡仪充分悬浮细菌细胞。注：充分重悬有利于菌体裂解和中和。
缓冲液A1是碱性的，有渗透压，容易使细胞裂解，缓冲液B1使得细胞裂掉、变透明，缓冲液N1是酸性的，将溶液给中和过来的，诱导蛋白质沉淀将最后提取出来的质粒测浓度时，加EB的溶液要用EB作为空白参照物来测，加水的溶液要用水作为空白参照物来测。
4.加入 250μL Buffer B1，轻轻地反转 10次以混匀（不要涡旋），室温静置 5 min。注：静置时间不要超过 5 min，时间过长会导致基因组污染或质粒损伤。注：Buffer B1低于室温会结晶，使用前在 37℃预热 Buffer B1使沉淀溶解。
5.加入 350μL Buffer N1，立即反转/振荡 5-10次以混匀。注：冰上静置 1 min有助于提高得率。
6. 12,000 rpm离心 10 min。注：若裂解液不澄清，将管子转一个角度，再离心 5 min，将澄清的裂解液转移至 Mini Column。
7.小心将上清液转移至 Mini Column（自带 2 mL Collection Tube）中，避免吸到沉淀，12,000 rpm离心 1 min，弃滤液，将 Mini Column放回至 2 mL Collection Tube。
8.可选：加入 500μL Buffer KB，12,000 rpm离心 1 min，弃滤液，将 Mini Column放回至 2 mL Collection Tube。注：此步骤对于 end A+菌株例如 HB101，JM110，JM101及其衍生菌株是必要的，而对于 end A-菌株例如 DH5α和 TOP10是不必要的。
9.加入 500μL DNA Wash Buffer(使用前按要求加入乙醇)， 12,000 rpm离心 1 min，弃滤液。可选：重复步骤 9。
10.将 Mini Column开盖放回至 2 mL Collection Tube，12,000 rpm离心 2 min。注：残留的乙醇可通过打开柱盖离心的方式去除，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。
11.将 Mini Column转移至一个干净的 1.5 mL离心管，在膜中央加入 50-100μL（>50μL）Elution Buffer或 ddH2O，静置 1 min， 12,000 rpm离心 1 min洗脱质粒 DNA。
可选：将洗脱下来的液体重新上柱，二次洗脱。
注：第一次洗脱通常得到 70%左右的质粒。二次洗脱有利于回收剩下 20~30%的质粒 DNA。
注：纯化得到的质粒 DNA可直接用于下游实验例如基因克隆、RFLP、文库筛选、体外翻译、测序等。
注：若用于内毒素敏感细胞系、原代细胞的转染及显微注射，建议购买 PD1212。
12. DNA浓度可通过以下方式计算，
DNA浓度（μg/mL）=OD260nm×50×稀释倍数
二、试剂盒提取质粒原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、转染细胞的质粒提取时用什么试剂盒好
1、转染细胞的质粒提取时用什么试剂盒好
2、实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒，转染细胞没问题。
3、我觉得只要是注意以下2点就可以了：
4、1，注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染，收集菌体沉淀时防止菌液散落，经常用75%的乙醇擦拭手套。
5、2，最后洗脱时最好使用无内毒素的水，我们是用注射用水的。
6、无论是小提还是大提我们都是用的日常型的，并没有刻意用转染级的，因为转染量大，去内毒素的操作太麻烦，损失太大。
四、谁能推荐个质粒大量提取试剂盒
博凌科为的质粒大量提取试剂盒蛮不错的，我们实验室现在一直在使用
他们的这款试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2、不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，从100-200ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-0.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80%左右。
3、获得的质粒产量高、超螺旋比例高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
五、质粒的提取方法
从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等。
在氢氧化钠（pH12.0-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下，细菌蛋白质变性，细胞破裂，细菌染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变形。
但由于质粒DNA相对分子质量较小，公价闭环的DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态，呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离。
将pH调至中性并有高盐存在的条件下，变性质粒DNA又恢复到原来的构型，而大部分染色体DNA和蛋白质难以复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
通过离心沉淀，细胞破碎、染色体DNA及大部分蛋白质等可被出去，而质粒DNA及相对分子质量较小的RNA仍为可溶状态。混杂的RNA可用RNA酶消除，再用酚／氯仿处理，可除去残留蛋白质。在盐和乙醇存在的条件下，进一步离心沉淀质粒DNA。
根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。
根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。
松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。
根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。
参考资料来源：百度百科-质粒抽提
OK，关于质粒提取的注意事项和试剂盒提取质粒原理的内容到此结束了，希望对大家有所帮助。
